色譜雙峰指的是明明是同一種物質(zhì),但在色譜圖中卻呈現(xiàn)雙峰,讓實驗人員誤認(rèn)為含有兩種物質(zhì)。為什么會出現(xiàn)這種現(xiàn)象,在實驗過程中我們又將如何避免這樣的事情發(fā)生。
在HPLC分析中,在色譜柱正常,樣品濃度適宜,分析方法合適,色譜峰在出峰時間較短的條件下,峰型應(yīng)對稱而尖銳。但在實際操作中,如果對樣品不了解,前處理不恰當(dāng)或者分析方法不合理等,會出現(xiàn)峰形不正常的情況,其中雙峰現(xiàn)象就是液相色譜中常見的問題之一。出現(xiàn)色譜雙峰的原因一般有以下幾種:
01、色譜柱
如果在樣品分析時發(fā)現(xiàn)每個色譜峰都有雙峰出現(xiàn),尤其在采用單一純物質(zhì)時,則可以確定是色譜柱出現(xiàn)問題了,一般是柱頭受損或者柱頭固定相污染引起的。
如果進(jìn)樣量少,原來色譜柱正常,色譜峰的形狀多為一大峰帶一小峰,不一定拖尾,這一般應(yīng)是柱頭受堵,將色譜柱反過來接,用流動相沖洗或酸洗或其它溶劑,將堵在柱頭的殘留物沖掉,再反過來,一般情況下就行了。當(dāng)然不反沖,正沖有時也會正常的。
如果峰拖尾,雙峰強(qiáng)弱相差不大,柱頭固定相變臟或流失可能性更大,這時可以將進(jìn)樣頭擰開,將微孔濾片超聲,柱頭刮去一部分填料,重新填上新填料擰緊,不過這個對技術(shù)要求較高且不能經(jīng)常做,否則用不了幾次,色譜柱就會應(yīng)柱效降低而報廢。
如果上述不能解決問題,可能是柱塌陷造成的,此時需要更換色譜柱。
02、溶劑問題
目前HPLC分析多為反相色譜,流動相多為甲醇、乙腈、水,加各種添加劑以改善分離性能。樣品一般用與流動相相溶的溶劑溶解,最佳的溶解方法是用流動相溶解。在實際分析中,有時候為了樣品的溶解性或穩(wěn)定性加入了一點的緩沖液,緩沖液的酸堿性可能會導(dǎo)致樣品轉(zhuǎn)化,從而產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象。此時需要更換緩沖液,調(diào)整溶劑pH值,或者用流動相配置樣品。
此外,樣品要現(xiàn)配現(xiàn)用,避免樣品溶解液的有機(jī)相比例、pH值發(fā)生變化而導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)。
03、進(jìn)樣量
當(dāng)用溶劑極性強(qiáng)度大的試劑,如純甲醇、純乙腈,純乙醇,而分析體系中以水為主時,如果樣品進(jìn)樣量大,如定量管為20ul,此時單一的純物質(zhì)會出現(xiàn)雙峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一樣),且拖尾,保留時間會提前(相對進(jìn)樣量少而言),將進(jìn)樣量減少一半以上,峰型將變?yōu)檎?。這是樣品的溶劑與流動相極性相差太大,而流動相來不及將其稀釋達(dá)到平衡造成的,此情況下需要減少進(jìn)樣量。
另一個原因是,進(jìn)樣量不一定大,但絕對量很大,色譜圖上的雙峰緊靠在一起,基本上齊高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進(jìn)樣就可以了,這是由于進(jìn)樣量過大,色譜柱過載造成的。
04、pH值
體系pH值對色譜雙峰的影響出現(xiàn)在各個環(huán)節(jié)上(前面已經(jīng)提到),尤其在緩沖液流動相平衡過程中其影響更為明顯。當(dāng)連續(xù)進(jìn)樣時,受pH的連續(xù)變化影響會經(jīng)常遇到這種雙峰的情況。
另外,在樣品分析時,流動相的pH盡量遠(yuǎn)離被分析物的等電點,否則也容易引起雙峰的產(chǎn)生。在用離子對試劑分析時,選擇不好條件也會容易引起雙峰的產(chǎn)生。
05、樣品特性
有些樣品由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)的特點,存在互變異構(gòu)現(xiàn)象,而這種互變異構(gòu)體無法分開,而是以一個動態(tài)平衡存在。在色譜分析時,在一個特定的條件下(如pH值、流動相極性、溫度等),一種物質(zhì)將出現(xiàn)雙峰,雙峰靠的很近,基本齊高,不拖尾,條件稍一變化,尤其pH,雙峰現(xiàn)象將消失,如紅霉素等。
有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰,但在LC-MS下,用質(zhì)譜檢測器,其質(zhì)譜的總離子流圖上較明顯,如農(nóng)藥啶蟲瞇(吡蟲清)。
06、儀器參數(shù)設(shè)置不合理
參比波長設(shè)置錯誤,例如設(shè)置分析波長254nm,參比波長400nm,這個對于大多數(shù)化合物可能沒影響。但是如果被測化合物,在400nm處也有強(qiáng)的紫外吸收,比254nm更高。這樣其出峰時,由于背景的抵扣作用,本來一個峰會變成對稱的二個峰,而且如果將二峰之間的峰谷反轉(zhuǎn)180度,恰好是一個完整的峰。這時要將參比波長設(shè)置更大,或者取消。
07、小結(jié)
在對樣品了解程度不夠,方法不當(dāng),樣品處理方法及進(jìn)樣方式不合理情況下,會出現(xiàn)各種意想不到的問題,而對色譜峰難以作出合理的解釋,尤其對于新手更是如此,所以,了解每種異常出現(xiàn)的原因,并根據(jù)原因采取合理的改進(jìn)措施,是避免異常峰出現(xiàn)的最有效的辦法。